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兔波氏杆菌病的实验室诊断

兔波氏杆菌病又称为支气管败血波氏杆菌病，引起兔的一种以慢性鼻炎、支气管肺炎及咽炎为特征的呼吸道传染病。

1　病原学诊断

1.1　细菌培养

样品采集：病兔，将灭菌棉拭子在无菌生理盐水中浸湿，插入病兔鼻腔内，深约10mm，小心转动，蘸取鼻汁；死亡兔或扑杀致死兔，取鼻腔、气管、肺部病变材料用于细菌分离培养。

细菌分离：将附着在棉拭上的黏液涂抹在麦康凯培养基或DHL培养基上，37℃培养48h。肺部病变材料进行培养时，还可用血液琼脂培养基。

结果判定：在改良麦康凯培养基上，支气管败血波氏杆菌菌落直径约1~2mm，圆整、光滑、隆起、透明，略呈茶红色，较大菌落中心厚，呈茶黄色。在DHL琼脂平皿上形成无色半透明，2mm左右菌落。

1.2　病原鉴定

生化试验:不发酵碳水化合物，葡萄糖、荒糖、乳糖、甘露醇、果糖木糖呈碱性反应。M.R.试验、靛基质试验、硫化氢产生阴性，V-P试验、枸橼酸盐利用、尿素酶产生、硝酸盐还原、运动力试验阳性。

动物接种试验:常选用幼兔或豚鼠，鼻内接种4h培养物0.1mL，应在几天内出现鼻炎和肺脓肿的典型症状和病理变化。0.5mL剂量耳静脉接种家兔，应于24~48h内死亡。从死亡兔的病变组织及扑杀的活兔的肺脏中均可分离到本菌。

血清平板凝集反应:在清洁的玻片上加一滴阳性血清（约0.3mL），充分混入一铂圈被检菌，轻轻晃动玻片，室温下放置2min。液滴中出现大凝集块或小的粒状凝集物，液体透明，判为阳性。每次试验应设有阴性血清对照和缓冲生理盐水对照。结果判定：液滴中出现大凝集块或小的颗粒状凝集物，液体透明，判为阳性。

免疫荧光检测抗原:应用直接荧光抗体技术，检查鼻甲骨、气管、细支气管及肺脏上皮细胞，观察到颗粒样抗原者判为阳性。该试验一般在感染后7~28天即可检出抗原。

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2.　血清学诊断

2..1　凝集反应

将Ⅰ相菌接种到胰蛋白酶大豆肉汤中，37℃培养24~48h，加福尔马林灭活，作为抗原。取凝集抗原与系列稀释的被检血清等量混合，37℃　2h或56℃　30min。4℃作用1夜判定。结果为1∶10被检血清呈现明显颗粒状凝集者判为阳性。家兔在感染后2~4周，即可从血清中测出凝集抗体。

2..2　免疫扩散试验

抗原制备:将Ⅰ相菌接种在含绵羊鲜血的鲍-姜琼脂培养基上，37℃潮湿温箱中培养36h，向生长良好的Ⅰ相菌培养物中加入缓冲生理盐水，充分振荡后，使菌体分散于溶液中而制成悬液，其菌数为2500亿/mL，再添加福尔马林使其含量为0.37%（甲醛0.15%），摇匀，瓶口加盖胶塞，放置37℃温箱（大约18~20h），次日取出，放室温3~5天，每天振荡3次。以500~1000转/min离心沉淀20min，弃上清液；缓冲盐水洗涤沉淀物，12000~15000转/min离心20min，弃上清液；向沉淀加少量缓冲盐水，按万分之一比例加入硫柳防腐。采用辐射免疫扩散法（将其8倍沉淀抗体滴度的抗血清，按10%比例加入到1%琼脂糖Tris缓冲溶液中，制成反应板，然后打孔，室温下湿室作用即可）测定，在反应板上出现直径10mm±1mm明显沉淀者为合格抗原。分装后4℃保存。

阳性血清制造:将上法接种于鲍-姜氏培主基上的Ⅰ相菌用灭菌PBS洗下，记数后加入福尔马林灭活，耳静脉注射3~6月龄的经支气管败血波氏杆菌免疫扩散法检查阴性的健康家兔，每只兔1mL。次菌数为100万/mL，以后每周加强免疫1次，每次菌数递增10倍，计6次。一次注射后4~5天采血，用免疫扩散法测定抗体滴度在8倍以上为合格，第七周自心脏采血，无菌收集血清。

免疫扩散试验配制:0.7%~1.0%的琼脂糖Tris反应板，按试验方法打孔，并在相应孔中加入抗原或血清。室温下湿室中作用，第二天开始判定，逐日观察记录结果，3天后判定。抗原孔与被检血清孔之间形成一条致密的沉淀线并且其末端与毗邻的阳性血清孔与抗原之间的沉淀线相融合者判为阳性，阳性血清与抗原孔之间的沉淀线末端相毗邻的被检血清孔之抗原方向偏弯者亦判为阳性。观察时可借助灯光或自然光源，特别是弱反应须在强烈的日光灯光源照射下才能看清沉淀线。

采用本法检查时，家兔被支气管败血波氏杆菌感染后7~10天即可检出血清抗体，血清中沉淀抗体的存留期在1年以上。本法与细菌分离的符合率在95%左右。

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獭兔幼兔成活率高的关键几点

幼兔饲养期是獭兔死亡率较高的时期，其死因一是应激影响，如饲料、笼舍的改变、防疫接种、防病投药等因素引起的应激刺激；二是营养不良，体弱多病或先天不足；三是管理不善，笼舍拥挤、潮湿，饲料霉变等。根据个人多年的养殖经验，做好以下几点可以提高獭兔幼兔的成活率：

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首先是温度，出生幼兔极限温度是5度以上，垫草要充足。如果出生温度低，就算是勉强救活也撑不了几天，还是会死亡的。

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草粉47 豆泊14 玉米15 夫皮15 预混料4 石粉1 鱼肝油 大蒜素 益生菌 土霉素 氯苯胍和地克珠立两月交替使用，按说明量2倍添加，饲料配比为什么和专家的不一样呢，个人不做太多解释，实践中得来的。要的是成活率。 到二月半龄换料增肥饲料配方 草粉40 豆泊17 夫皮20 玉米15 预混料4 葡萄糖4 氯苯胍和地克珠立两月交替使用，按说明量2倍添加。

注：一般的兔预混料里都含有地克珠利，但数量达不到控制球虫效果。

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兔粪养猪方法和兔粪的作用 

兔是草食动物，吃进的饲料未被完全消化吸收，因而排出的粪中仍含有较高的营养。兔粪中含粗蛋白质9．2％，粗脂肪1．7％，无氮浸出物52％，总灰分8．2％，还含有烟酸、泛酸、维生素B12等。实践证明，兔粪是一种好饲料，用兔粪喂畜禽鱼类，能很好地被消化吸收和利用，例如：  

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1)兔粪养猪

国内外用兔粪养猪的报道很多，许多养兔户用兔粪喂猪，节省了精料，增加了经济收入。综合养兔户用兔粪喂猪的方法有下列几种：

用鲜兔粪直接养猪。

用一口大锅烧开水(按水粪1：2 比例加水)，将捡去杂质的新鲜兔粪放入锅内煮沸5～10分钟， 再加入混合精饲料(兔粪占30％，40％，精饲料占60％～70％)继续煮沸3～5分钟，并将兔粪球搓开搅拌，使粪料混合均匀，成稠粥样。待温凉后即可饲喂，每天可喂3～4次。用兔粪喂肥猪，每头可节省50～100千克混合精料，喂母猪每只可节省混合精料175千克。15～20只成年兔粪可供一头母猪食用。

第二兔粪发酵后养猪。发酵法有两种：

一是将收集到的新鲜兔粪去掉杂物，晒干砸碎装缸，每10千克干兔粪加6～7千克水、0．1～0。2千克食盐，搅拌均匀，装缸八成满，然后将缸口用塑料薄膜密封发酵。发酵时间：夏季 2～3天，春秋季5～10天，冬季15～20天。 

二是将收集到的新鲜兔粪去掉杂物，搓碎后拌入饲料(水草、菜叶、洋槐叶等)，粪与青饲料按3：1的比例。再加入0。5％～1．0％食盐和适量清水，加水量以手攥紧不滴水，一松手又散开为度，然后装缸压实，在其上边再加上2～3厘米厚的麸皮、米糠等，以便保温。一般装八成满，将缸口用塑料薄膜或粘土封严发酵，热天经2～3天，冷凉天经8～15天即可发酵好。发酵后有酸香味，适口性好，猪喜吃。

第三晒干粉碎后喂猪。此法比较简便。

将收集到的鲜兔 粪去掉草和杂质，在阳光下晒干后粉碎，配合混合精料直接用来喂猪，粪料比可为3：7。

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2)兔粪种菇

烟台美吉尔兔业有限公司利用兔粪干物质含量、粪球圆硬光滑、间隙均匀、透气性好的特点，成功地开发出以兔粪为主，添加农作物秸秆作培养基栽培食用菌的方法。利用兔粪栽培的食用菌营养丰富、味道鲜美，其质量一点不比用其他方法生产的食用菌差。

兔粪栽培食用菌的方法是，培养料中兔粪与农作物秸秆的比例为1：1，再按总料重的3％加入生石灰，搅拌均匀，装袋接上菌种，菌种用量在10～13％为宜。中秋节前后接种，经20多天的发菌时间，就开始采收上市。

在中等管理水平下，以兔粪和秸秆的干物质为标准计算，鲜菇生物转化率可达200％，也就是说可用1公斤干料，生产出2公斤鲜菇。

3)兔粪养鸡

国内外关于兔粪养鸡的报道很少。经在河北省藁城畜牧场用干兔粪代替17．5％玉米喂艾维因试验，试验组与对照组无明显差异，说明兔粪可以代替部分玉米饲喂。

4)兔粪养鱼

用新鲜兔粪喂鱼：

把清扫的兔粪，去掉杂质，滤干兔尿后，直接用板锹，将兔粪扬撒在鱼池里，密度可按每10平方米1公斤兔粪。可全部按水面撒，也可分片撒，5天至10天撒一次。据观察发现，鱼儿爱吃软兔粪，硬兔粪被水泡开后鱼儿吃兔粪糜。

兔粪发酵生蛆和养蚯蚓喂鱼：

当自然气温在20℃以上，在池边挖沟，宽30cm~50cm，深40cm，沟内铺20cm厚的兔粪，再盖20cm厚的土，用喷壶浇透水。15天至20天或更长的时间，当挖开兔粪沟发现兔粪生蛆或有蚯蚓时，将兔粪和蛆、蚯蚓一同扬进鱼池里。兔粪肥水，鱼吃蛆和蚯蚓，达到水肥鱼壮的目的。 

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