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兔波氏杆菌病的实验室诊断

兔波氏杆菌病又称为支气管败血波氏杆菌病，引起兔的一种以慢性鼻炎、支气管肺炎及咽炎为特征的呼吸道传染病。

1　病原学诊断

1.1　细菌培养

样品采集：病兔，将灭菌棉拭子在无菌生理盐水中浸湿，插入病兔鼻腔内，深约10mm，小心转动，蘸取鼻汁；死亡兔或扑杀致死兔，取鼻腔、气管、肺部病变材料用于细菌分离培养。

细菌分离：将附着在棉拭上的黏液涂抹在麦康凯培养基或DHL培养基上，37℃培养48h。肺部病变材料进行培养时，还可用血液琼脂培养基。

结果判定：在改良麦康凯培养基上，支气管败血波氏杆菌菌落直径约1~2mm，圆整、光滑、隆起、透明，略呈茶红色，较大菌落中心厚，呈茶黄色。在DHL琼脂平皿上形成无色半透明，2mm左右菌落。

1.2　病原鉴定

生化试验:不发酵碳水化合物，葡萄糖、荒糖、乳糖、甘露醇、果糖木糖呈碱性反应。M.R.试验、靛基质试验、硫化氢产生阴性，V-P试验、枸橼酸盐利用、尿素酶产生、硝酸盐还原、运动力试验阳性。

动物接种试验:常选用幼兔或豚鼠，鼻内接种4h培养物0.1mL，应在几天内出现鼻炎和肺脓肿的典型症状和病理变化。0.5mL剂量耳静脉接种家兔，应于24~48h内死亡。从死亡兔的病变组织及扑杀的活兔的肺脏中均可分离到本菌。

血清平板凝集反应:在清洁的玻片上加一滴阳性血清（约0.3mL），充分混入一铂圈被检菌，轻轻晃动玻片，室温下放置2min。液滴中出现大凝集块或小的粒状凝集物，液体透明，判为阳性。每次试验应设有阴性血清对照和缓冲生理盐水对照。结果判定：液滴中出现大凝集块或小的颗粒状凝集物，液体透明，判为阳性。

免疫荧光检测抗原:应用直接荧光抗体技术，检查鼻甲骨、气管、细支气管及肺脏上皮细胞，观察到颗粒样抗原者判为阳性。该试验一般在感染后7~28天即可检出抗原。

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2.　血清学诊断

2..1　凝集反应

将Ⅰ相菌接种到胰蛋白酶大豆肉汤中，37℃培养24~48h，加福尔马林灭活，作为抗原。取凝集抗原与系列稀释的被检血清等量混合，37℃　2h或56℃　30min。4℃作用1夜判定。结果为1∶10被检血清呈现明显颗粒状凝集者判为阳性。家兔在感染后2~4周，即可从血清中测出凝集抗体。

2..2　免疫扩散试验

抗原制备:将Ⅰ相菌接种在含绵羊鲜血的鲍-姜琼脂培养基上，37℃潮湿温箱中培养36h，向生长良好的Ⅰ相菌培养物中加入缓冲生理盐水，充分振荡后，使菌体分散于溶液中而制成悬液，其菌数为2500亿/mL，再添加福尔马林使其含量为0.37%（甲醛0.15%），摇匀，瓶口加盖胶塞，放置37℃温箱（大约18~20h），次日取出，放室温3~5天，每天振荡3次。以500~1000转/min离心沉淀20min，弃上清液；缓冲盐水洗涤沉淀物，12000~15000转/min离心20min，弃上清液；向沉淀加少量缓冲盐水，按万分之一比例加入硫柳防腐。采用辐射免疫扩散法（将其8倍沉淀抗体滴度的抗血清，按10%比例加入到1%琼脂糖Tris缓冲溶液中，制成反应板，然后打孔，室温下湿室作用即可）测定，在反应板上出现直径10mm±1mm明显沉淀者为合格抗原。分装后4℃保存。

阳性血清制造:将上法接种于鲍-姜氏培主基上的Ⅰ相菌用灭菌PBS洗下，记数后加入福尔马林灭活，耳静脉注射3~6月龄的经支气管败血波氏杆菌免疫扩散法检查阴性的健康家兔，每只兔1mL。次菌数为100万/mL，以后每周加强免疫1次，每次菌数递增10倍，计6次。一次注射后4~5天采血，用免疫扩散法测定抗体滴度在8倍以上为合格，第七周自心脏采血，无菌收集血清。

免疫扩散试验配制:0.7%~1.0%的琼脂糖Tris反应板，按试验方法打孔，并在相应孔中加入抗原或血清。室温下湿室中作用，第二天开始判定，逐日观察记录结果，3天后判定。抗原孔与被检血清孔之间形成一条致密的沉淀线并且其末端与毗邻的阳性血清孔与抗原之间的沉淀线相融合者判为阳性，阳性血清与抗原孔之间的沉淀线末端相毗邻的被检血清孔之抗原方向偏弯者亦判为阳性。观察时可借助灯光或自然光源，特别是弱反应须在强烈的日光灯光源照射下才能看清沉淀线。

采用本法检查时，家兔被支气管败血波氏杆菌感染后7~10天即可检出血清抗体，血清中沉淀抗体的存留期在1年以上。本法与细菌分离的符合率在95%左右。

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 随着免业养殖模式的深度变革，以庭院 式小规模、副业型、低效益的传统养兔逐渐被快速普及推广的规模化饲养、工厂化管理、效益型工厂化养殖所替代。而工厂化养殖的基础条件之一，是必须有较高标准的兔舍和新式(欧式)笼具的配套使用。在最近几年生产和安装实践中，笔者认为新型兔舍和新式笼具配套使用必须遵循以下原则。

1 ; 控温控湿

      传统的庭院式养兔， 一般使用的笼具基本上不具备自动清粪的功能，且繁殖与育肥大部分是分开的，旧房利用和临时搭建的大棚不具备控温条件。现在我们学习和借鉴欧州先进的饲养理念，每栋兔舍每套笼具都同时具备繁殖和育肥的双重功能，兔舍轮换使用，循环清空消毒，实施人工授精，温度控制,灯光照射，药物、集中产仔，定时全进全出，既稳定了正常的生产指标，提高了饲养效率，又通过封闭消毒防控了各类疾病的发生。正因为如此，舍内温变调剂就尤其重要。2013 年，四川金富现代农业有限公司陈红等4位 专家在《温度对家兔的影响及其控制》一文中,对温度对家兔的五大影响(体温、生长、繁殖、疾病、皮毛)都作了详尽的分析，常年舍温的控制值为15-25°C,这就要求我们为了便于控温，在兔舍的选址上就应注意地势高燥平坦、背风向阳、地下水位低、排污方便、远离车来人往和声音嘈杂的交通道口和人群密集区，特别要考虑，冬夏两个季节，在小免密集繁殖产仔时，室内低于8°C的区域,必须配人工增温设施，夏季室内超过28°C,在负压降温的环境中，风机和湿市同时开放的时间自然延长，按照幼免 和成年兔不同时期对温度的适应程度适时调剂, 做到平稳均匀。

2自动清粪
免舍内空气的质量，事关到能否给免群提供- . 个舒适的生存环境，是至关重要的。目前，国内主要是采用水冲、刮板机和地沟配合清粪，有条件的工厂已经开始推广大型履带 式清粪，效果非常明显，舍内没有任何
气味，但是由于一一次性投入成本较高，直接影响到大范围推广，但不论采取那种形式，笼具的设计和安装必须与自动清粪匹配，才能达到净化空气的效果，目前一-部分规模化养殖场的清粪设备、笼具配套还存在不少缺陷。青岛康大食品有限公司的技术总监阎英凯先生在《肉兔工厂化养殖模式》一文中，不但给我们提出了风机和水帘的安装技术要领，同时对笼具的导粪板的倾斜度也提出了严格要求，不管是单层笼、双层笼或三层笼导粪板的倾斜度都必须达到45以 上，保证粪便自然滚落到粪尿沟中或落入履带之上。

3科学布局、综合规划
近几年，凡是具备条件的养兔企业和各类专业合作社，旧舍改造的不是很多，大部分是新场地新规划，新兔舍配套新笼具，切记在规划初期就做到不管新建规模大小或投资批次多少，一定要把集中饲养区、生活办公区、消毒隔离区、粪便排污区、粪便集中处理区同时进行规划。把饲养区内的净道、污道截然分开，风机、水市的安装位置和清粪机安装位置标明清楚，净道 (安装水帘)可以对列在一条通道内，但污道必须分开。因为排风机在工作时，不但是降温，调整兔舍内空气质量的同时也把舍内污浊气体、空中飞毛及室内产生的氨气同时排出。如果这栋兔舍的污浊气体又吹到另-栋兔舍里去了，就前功尽弃了。平时，免舍内除工人和管理人员外，是不允许闲杂人进出的，这就要求我们不但要有制度的保证，更要做到设计之初就把硬件设施同步跟上。
新型笼具配套新型兔舍，以其饲养效益的显著提升，工厂化管理的配套应用，养免产业的必然发展方向，先进养殖理念的具体体现已被越来越多的同业者认可，是大势所趋。胜顺畜牧器材有限公司周经理近几年去过不少地方，在帮助企业设计规划和近几年加工新型笼具的实践经验，浅薄地提出一些自己的见解，供同业者参考，很多不足之处，请专家学者及同行精英修正。

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长毛兔新品种:豫系长毛兔养殖经济效益高

豫系长毛兔2005年通过了河南省科技厅鉴定。豫系长毛兔具有体型大、产毛量高的特点，它繁殖力很强、且耐粗饲、又抗病力强，豫系长毛兔幼兔早期生长快，因此养殖豫系长毛兔经济效益高，现在很受中原地区养殖户青睐。

1.体型。成年公兔平均体重 5138克、体长56厘米、胸围37.7厘米，个体体重6300克；成年母兔平均体重5556.4克、体长59.9厘米、胸围38.9厘米，个体体重7800克。

2.产毛量和产毛率。成年公兔平均单次产毛量达389.8克，年产毛量达1925克，的个体单次产毛量达550克、年产毛量达2750克，平均产毛率37.5％；成年母兔平均单次产毛量达403克，年产毛量达2015克，的个体单次产毛量达593克、年产毛量达2965克，平均产毛率36.9％。粗毛率为16.1％。

3.繁殖性能。每胎平均产仔8.6只，产活仔率96.5％；断奶时平均每胎成活仔兔7.6只，断奶成活率92.1％。每胎产仔16只，断奶时的母兔窝内仔兔平均重1312克。

4.生长发育情况。（1）母兔：2月龄平均体重1580克、体长23.9厘米、胸围17.25厘米、单只产毛量23.2克；5月龄平均体重3617克、体长38.7厘米、胸围 27.2厘米、单只产毛量292克；8月龄平均体重4668克、体长50.4厘米、胸围36.4厘米、单只产毛量416克。（2）公兔：2月龄平均体重1574克、体长23.3厘米、胸围16.4厘米、单只产毛量22.7克；5月龄平均体重3611克、体长37.8厘米、胸围27.1厘米、单只产毛量290克；8月龄平均体重4664克、体长49.8厘米、胸围36.3厘米、单只产毛量404克。

豫系长毛兔品种培养历历程：

1、豫系长毛兔培育的背景

台前县良种长毛兔繁育总场始建于1981年，1983年河南省畜产品进出口公司从西德引进一批良种长毛兔，兔要进来了，兔场尚没落实好，于是台前县良种长毛兔繁育总场经过努力争取到了100只西德长毛兔原种兔。老场长姜佃成先生开始了西德长毛兔的纯种繁育工作，现任场长姜继民是该场饲养员。1984-1986年兔毛销售形势较好，本场繁殖的西德长毛兔除自己选留一部分个体外，都被周围养户买走，对本地长毛兔的发展起到了促进作用。当时西德长毛兔生产性能为成年兔体重3.5-4.0kg，体长45-50cm，年产毛量1008-1100g。主要优点是被毛密度大、毛细长而柔软，有毛丛结构，排列整齐而不易缠结，在当时已属良的品系了。但是，养兔户反映，西德长毛兔不耐粗饲，繁殖性能低，配种比较困难，初产母兔母性差……，主要是适应性差，对饲养管理条件要求高。

1987年兔毛销售形势降到低谷，1989-1990年形势又有了好转，就这样到1995年出现了兔毛销售三次周期性变化。每次兔毛销售走势向低时，他们都要对种兔群进行一次挑选，将的个体留下保存一个小种群，相对差的个体都淘汰，保存力量等待时机；当兔毛销售走势向高时，开始繁殖，先选留扩大自己的兔群，再供给其他农户。每一次兔毛销售周期性变化，他们的种兔品质提高一个档次。次压缩种群后引进法系安哥拉兔与自己种兔群中母兔杂交，选择后代中的个体留种。再后来，每到压缩种群后在等待时机时，他们就走出去参观、考察、学习，比较先进场家的种兔与本场种兔品质的差异，凡是品质比自己场高的，他们都会以极高的价格买回人家的种公兔，再与本场的母兔交配，选留其后代。就这样到1995年他们的种兔群品质已经很优良了。

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2、拟定培育目标，定向培育

2005年以前豫系长毛兔的培育是随形势的变化而为之，带有随意性，没有明确的培育目标。1995年在省科委的关怀下派省科学院生物研究所的研究人员去进行技术培训、技术指导，亲临指导的研究人员在详细考察本场种兔品质以后，认定本场种兔群品质已达到省内水平，建议定向选育，扩大种群，最终形成适合河南省乃至中原地区的地方优良品系。

在河南省科学院生物研究所科研人员的帮助下制定了培育目标。豫系长毛兔的培育是选择一些经济性状为观察、统计项目。一般把估测遗传力在0.2以下的称低遗传力性状，遗传力在0.4 的称高遗传力性状，遗传力在0.2-0.4之间的为中遗传力性状。遗传力高的性状通过个体选择在后代身上表现比较明显。年产毛量、仔兔断奶成活数为高遗传力性状；断奶窝重，青年兔6月龄体重等为中遗传力性状。根据经济性状及其遗传力的情况，培育过程选择了以下几种经济性状作为改核指标，具体培育目标如下：

2.1体型：体表是载毛的部位，体重大的体表面积大，在毛的密度相近的情况下，体重大的个体产毛量高，当时种群平均体重在4kg左右，培育目标定为5kg左右，体长在55cm，胸围36-38cm。

2.2产毛量和粗毛率：产毛量与养兔经济效益呈正相关关系，产毛量是最重要的经济性，且遗传力高，也作为培育的改核指标。原基础兔群德系安哥拉兔年产毛量1008-1100g，当时本场兔群年产毛量1300g左右，培育目标定为年产毛量1750g，个体年产毛量达到2000g左右。个体在种群中占20%左右。粗毛率定为15%以上。

2.3繁殖力：繁殖力的遗传力较低，通过选育发掘其遗传潜力，结合良好的饲养管理条件，增加其后天获得性，促进繁殖力的提高。培育目标为年产5胎左右，受胎率在70%左右，胎产仔数7-8只，断奶成活率90%，断奶窝重7000g。

2.4耐粗饲、适应性强：中原地区跨越北亚热带和北暖温带两个气候带，南北气候条件有一定差异，通过杂交后的选育，培育出适应本地区饲料条件和气候条件的长毛兔品系。

3、培育方法：豫兔的培育方法分两个阶段，阶段为杂交选育阶段；第二阶段为定向选育阶段。

3.1杂交选育阶段：即在西德长毛兔品质的基础上引进法系安哥拉兔作父系进行杂交，对其后代进行选育，留下的后代作母本，又引进浙江的、山东的良种群中的公兔作父本，再次进行杂交选育。这样的工作在本场进行10年之久，初步形成粗毛型种群。

3.2定向选择阶段：经过近10年杂交选育，种群中已经融入了法系安哥拉兔及国内其他良种群的血统，1995年制定培育目标后，按照培育目标定向选择。每只良种核心群的种兔都经过4次选择。

次选择：在仔兔断奶时进行，即在胎产仔8只以上的窝内，断奶窝重在8000g以上的仔兔群中，挑选个体比其他都大的，发育良好的，体质健壮的仔兔作幼兔种兔培育。

第二次选择：在第二次剪毛时进行，日龄在4.5-5个月，主要是根据采毛量，采毛量250-300g留下继续作种兔培养；采毛量小于240g的淘汰。因为第二次采毛量与以后的年产毛量呈正相关关系。

第三次选择：在第三次采毛时进行，时间在7-8月龄。这时主要根据产毛性能。生长发育情况和外貌鉴定进行复选。第三次采毛量与年产毛量有较高的正相关关系。在生产实践中，有的用第三次采毛量乘以4作为年产毛量的估测依据。第三次采毛量在380g以上的放入核心群，低于380g的放入生产群。

第四次选择：在1周岁以后进行，主要根据繁殖性能和产毛性能选留。母兔初产的一胎产仔多少和护仔好坏不能作为选种的依据，通常2-3胎的受胎与否和胎产仔多少、产活仔多数才能作为繁殖性能的依据。第二、三胎准胎，胎产仔8只以上，母兔护仔性能好、泌乳性能好的留下，达不到以上要求的投入生产群。

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